番茄原產(chǎn)于南美西部高原，屬喜聞溫蔬菜，對溫度比較敏感。研究表明，番茄的整個生長發(fā)育過程中，生殖生長時期對溫度敏感，這主要是因?yàn)榛ǚ郯l(fā)育時期尤其是減數(shù)分裂和配子形成時期是植物生殖過程中高敏感階段，高溫容易造成花粉敗育，從而導(dǎo)致授粉受精不良、座果率下降、畸形果率升高等問題。應(yīng)對全球變暖這一嚴(yán)峻的環(huán)境問題，授粉前對花粉活性進(jìn)行檢測和篩選，則成為番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要保障。
本實(shí)驗(yàn)利用Ampha Z32花粉活力分析儀（IFC法）測試了采自多個國家的1000份番茄花粉的活性。圖1為1000份花粉活性的百分比堆積柱狀圖，其中綠色為活性花粉占比，紅色為死亡花粉的占比，紅圈內(nèi)為Ampha Z32花粉活力分析儀測量得到細(xì)胞散點(diǎn)云圖。如圖所示，圖中左側(cè)樣本的花粉活性幾乎達(dá)到了100%，右側(cè)樣本的花粉活性幾乎為0%，細(xì)胞散點(diǎn)云圖中清晰區(qū)分出活性細(xì)胞類群和失活細(xì)胞類群。對于第900-1000個樣本的花粉活性小于10%，不適用于育種或種子生產(chǎn)，將直接被淘汰。
圖1花粉活性百分比堆積柱狀圖
此外，本實(shí)驗(yàn)還利用體外萌發(fā)法驗(yàn)證了該方法的可靠性，分別采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽瓊脂培養(yǎng)基和改良的液體發(fā)芽緩沖液進(jìn)行培養(yǎng)。如圖2所示，對于IFC法測量的活力大于80%的花粉，使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，花粉的萌發(fā)率小于20%，二者差異顯著；而使用改良后的萌發(fā)緩沖液，花粉的萌發(fā)率明顯增高且與IFC法測量結(jié)果一致。由此可見，番茄花粉的萌發(fā)受培養(yǎng)基類型的影響差異較大，選擇合適的培養(yǎng)基是準(zhǔn)確判斷花粉萌發(fā)率的前提，在合適的培養(yǎng)條件下，IFC法與體外萌發(fā)法一致性極高，是一種可靠、便捷的測試方法。
圖2. IFC法與體外萌發(fā)法的相關(guān)性分析
標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽瓊脂培養(yǎng)基(■)和改良的液體發(fā)芽緩沖液(●)。藍(lán)色和綠色虛線分別代表相應(yīng)的相關(guān)性方程和相關(guān)系數(shù)，Y誤差線表示萌發(fā)法的標(biāo)準(zhǔn)偏差，X誤差線表示IFC法的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
對比1000份番茄花粉的活性散點(diǎn)圖（橫坐標(biāo)為相對活性，縱坐標(biāo)為相對大?。?，我們發(fā)現(xiàn)大部分花粉的活性散點(diǎn)圖，失活細(xì)胞相較于活性細(xì)胞可劃分為兩個部分，一部分細(xì)胞的位置與活性細(xì)胞一致，而另一部分則明顯低于活性細(xì)胞，結(jié)合顯微鏡鏡檢，我們發(fā)現(xiàn)這部分位置靠下的細(xì)胞體積較小且形狀不規(guī)則。由此，我們將花粉細(xì)胞三個類群：成熟的活花粉，成熟的死花粉以及異?；ǚ?，如圖3所示。
圖3. 花粉的活性散點(diǎn)圖中的花粉類別
為進(jìn)一步了解異?；ǚ蹖ǚ刍钚缘挠绊?，本實(shí)驗(yàn)研究了1000個樣本中，異常花粉在失活花粉中的占比以及異?；ǚ墼谡麄€花粉樣本中的占比。
圖4.異?；ǚ墼谒劳龌ǚ壑械恼急扰判驁D
圖4為異?；ǚ墼谑Щ罨ǚ壑械恼急扰判驁D，紅色為成熟的死花粉，藍(lán)色為異?；ǚ?。如圖可見，這1000個樣本基本都含有異常花粉，其中有10%的樣本，異常花粉在失活花粉中的占比達(dá)到了40%以上。
圖5. 異常花粉在整個樣本中的占比
圖5為異?；ǚ墼谡麄€樣本中的占比，從圖中我們可以看出，對于大多數(shù)樣本來說，異?；ǚ鄣恼急燃s為5%，而個別樣本的異常花粉卻超過了50%，甚至達(dá)到了87.3%。顯然，異?；ǚ凼菍?dǎo)致這部分樣本花粉活力降低的主要因素。這些異?；ǚ壑饕獮榛ǚ郯l(fā)育的過程產(chǎn)生空花粉、不育花粉、退化花粉、損傷花粉或畸形花粉，它們體積較小，形狀皺縮不規(guī)則，與花粉發(fā)育過程中受到的脅迫，尤其是熱脅迫密切相關(guān)，可作為判斷番茄在生長中是否受到脅迫的指標(biāo)。
最后，本實(shí)驗(yàn)通過對比1000份番茄花粉的活性散點(diǎn)圖，按散點(diǎn)圖類型進(jìn)行了分類，如圖6，總體可分為四類：1）花粉活性較高，且?guī)缀鯖]有異常花粉；2）花粉活性適中，基本沒有異?；ǚ?；3）花粉活性非常低，基本沒有異常花粉；4）花粉活性中等，但含有大量的異?；ǚ?。根據(jù)以上結(jié)果，我們可以在今后的番茄生產(chǎn)過程中，盡可能的篩選活性高且無異常細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)花粉進(jìn)行授粉；以異常花粉的占比作為番茄生長是否受到脅迫的重要指示，幫助及時調(diào)整生產(chǎn)環(huán)境；此外，還可以幫助我們進(jìn)行耐熱抗旱品系篩選。
圖6. 不同質(zhì)量的番茄花粉散點(diǎn)圖
本實(shí)驗(yàn)表明Ampha Z32花粉活力分析儀（IFC法）無需染色等預(yù)處理，能夠快速、高通量、準(zhǔn)確測量花粉活性，并且可以通過對比篩選出優(yōu)質(zhì)花粉，是一種可靠的測試方法，可為番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要保障。
本次實(shí)驗(yàn)由瑞士Amphasys公司應(yīng)用科學(xué)家和荷蘭瑞克斯旺種苗集團(tuán)公司（Rijk Zwaan）的育種團(tuán)隊(duì)共同完成。